(录用定稿)网络首发时间:2019-06-11 16:57:35

miR-214靶向抑制CaMKⅡ调控H9c2心肌细胞的氧化应激

王艳赵然尊刘德斌刘围围李朝富王正龙陈文明石蓓

目的 探讨miR-214靶向抑制CaMKⅡ调节缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞氧化应激的作用。方法 采用大鼠H9c2心肌细胞为研究对象,实验分组为:(1)正常组:正常培养的心肌细胞;(2)缺氧复氧组:心肌细胞经缺氧24 h复氧6 h处理;(3)miR-214模拟物组:心肌细胞转染miR-214模拟物后予缺氧复氧处理;(4)miR-214模拟物阴性对照组:心肌细胞转染miR-214模拟物阴性对照后予以缺氧复氧处理。予以CCK-8法检测细胞活性,qPCR检测各组细胞中miR-214变化,流式细胞术、TUNEL法及SOD、MDA试剂盒法检测各组细胞氧化应激水平及凋亡效应;双荧光素酶报告基因检测miR-214与CaMKⅡ相关性,qPCR和Westernblot检测CaMKⅡ mRNA或蛋白表达变化。随后采用腺病毒转染过表达细胞中CaMKⅡ进行回复实验,并采用上述方法检测细胞氧化应激水平及凋亡状态。结果 CCK-8结果显示,与正常组比较,缺氧复氧诱导心肌细胞活性下降,而过表达miR-214可明显改善该作用(P<0.05)。qPCR结果表明,与正常组比较,缺氧复氧组miR-214表达下降,而过表达miR-214后,缺氧复氧条件下细胞中miR-214亦高表达(P<0.05)。与正常组比较,缺氧复氧导致细胞氧化损伤,包括细胞中ROS,MDA表达水平及Tunel阳性细胞数明显增高,而SOD表达下降(P<0.05),与缺氧复氧组相比,过表达miR-214组中ROS,MDA水平及Tunel阳性细胞数明显下降,SOD表达明显增高(P<0.05)。经Targetscan检测发现miR-214与CaMKⅡ存在结合位点,双荧光素酶报告基因也验证了在H9c2心肌细胞中miR-214可结合CaMKⅡ。此外,qPCR及Western blot结果表明,与正常组比较,缺氧复氧可致CaMKⅡ在m RNA及蛋白水平表达升高,miR-214可显著抑制缺氧复氧诱导的CaMKⅡ表达。采用腺病毒过表达细胞中CaMKⅡ后,miR-214抗氧化应激及凋亡效应被部分阻断。结论 过表达miR-214可通过抑制CaMKⅡ转录后翻译过程,改善H9c2心肌细胞氧化应激水平及凋亡状态。

国家自然科学基金地区项目(81760042,81860061); 贵州省科技计划项目(黔科合LH字[2017]7107号);

miRNA-214; H9c2心肌细胞; 活性氧,超氧化物歧化酶,丙二醛; CaMKⅡ;

10.16016/j.1000-5404.201901002

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