速效救心丸对糖氧剥夺诱导心肌细胞损伤保护作用的物质基础及作用机制研究

缺血性心脏病是影响人们生活质量和生命的一类重大疾病,这一类疾病占我国居民疾病死亡的40%以上。缺血性心脏病多是由于血管冠状动脉粥样硬化,导致冠状动脉病变,管腔狭窄,从而引起心肌供血不足,甚至心肌梗死的心血管疾病。速效救心丸是由川芎和冰片等制成的滴丸型中成药,临床多用于治疗冠心病心绞痛,缓解心肌梗死症状,是由国家级中成药制剂专家章臣贵教授研制成功的现代中药制剂,是我国传统中医药经典理论与现代制剂技术的首次结合产物,具有吸收快、起效快、生物利用度高、疗效高、服用方便等特点,在临床急救以及常规治疗中均取得很好的疗效。但目前速效救心丸的物质基础及其作用机制仍不明确,因而本课题将对其物质基础以及抗心肌缺血的作用机理进行深入研究,以期阐明其物质基础及药效作用机理,并为其二次开发提供科学依据。目前抗心肌缺血类药物的研究,多集中于在扩张血管、溶栓、抑制血小板聚集、促进血管新生等改善血流的角度去评价药物的抗心肌缺血作用,从源头上改善心肌缺血的病理状态。在血栓堵塞血管引发的急性心肌梗死的状态下,送医之前其改善血流的效果是极其有限的,因而此时在缺血状态下对心肌细胞的保护,是抗心肌缺血药物的重要保护机制。在缺血状态下,氧气供应不足,极易引发线粒体功能障碍,线粒体能量代谢紊乱,线粒体凋亡从而导致心肌细胞凋亡。因而本课题将以速效救心丸为研究对象,对其物质基础进行分析,并以体外糖氧剥夺细胞模型为技术手段,对其成药以及主要活性成分的线粒体保护的抗心肌缺血作用机制进行研究。主要研究内容如下:(1)采用UHPLC-QTOF高分辨质谱对速效救心丸成分进行分析,对其入血成分进行鉴定,通过HPLC-QQQ测定速效救心丸中阿魏酸,藁本内酯,洋川芎内酯-I,洋川芎内酯-H含量及灌胃给药30分钟后血中浓度。结果:通过对速效救心丸的成分进行分析,共鉴别得到15个化合物,其中有9个化合物在血液中也检测到,均为苯酞类化合物。速效救心丸中阿魏酸,藁本内酯,洋川芎内酯-I,洋川芎内酯-H含量分别为17.63μg/丸(含量符合国家药典标准),47.52μg/丸,35.07 μg/丸,4.91 μg/丸。大鼠灌胃162mg/mL速效救心丸4 mL后,取30 min血清检测得藁本内酯,洋川芎内酯-I,洋川芎内酯-H含量分别为64.19 ng/mL,336.80 ng/mL,131.65 ng/mL。上述结果表明藁本内酯为速效救心丸的主要成分,其在肝脏中容易发生Ⅰ相代谢生成以洋川芎内酯-Ⅰ主的代谢产物。(2)针对主要入血成分藁本内酯和洋川芎内酯-Ⅰ,通过电化学反应模拟藁本内酯在体内的Ⅰ相代谢,对藁本内酯代谢产物进行制备。首先通过电化学反应-质谱(EC-MS)联用技术对藁本内酯在体内的Ⅰ相代谢进行模拟和分析,发现藁本内酯发生氧化反应,生成洋川芎内酯-Ⅰ、洋川芎内酯-H、环氧藁本内酯,这与体内的代谢产物是一致的,进一步通过对反应电压、电解液、流速进行优化后,得到其最佳反应条件:电解液乙酸铵浓度:40mM,溶液pH值:7.4,流速:50 μL/min,反应电压:1.6V。然后选择制备电极大量反应,从120 mg藁本内酯制备并纯化得到洋川芎内酯-Ⅰ、洋川芎内酯-H和环氧藁本内酯各5 mg、2 mg、6 mg。为后述活性研究提供样品。(3)通过构建糖氧剥夺心肌细胞模型模拟体内心肌缺血环境。本文通过透射电镜观察线粒体形态,并采用seahorse细胞能量代谢分析系统考察线粒体呼吸链传递过程以及糖酵解水平,评价速效救心丸及主要成分藁本内酯、洋川芎内酯-Ⅰ对糖氧剥夺心肌细胞损伤后线粒体结构和功能变化的影响。结果表明:①通过透射电镜观察线粒体形态,发现糖氧剥夺后线粒体肿胀、嵴稀少、嵴不完整、且结构模糊,在给予速效救心丸及主要成分藁本内酯、洋川芎内酯-Ⅰ后,线粒体明显增多,且肿胀明显减轻,嵴较完整规则,结构较清晰,这说明速效救心丸及藁本内酯、洋川芎内酯-Ⅰ对缺糖缺氧环境下细胞内线粒体生理结构具有保护作用。②通过seahorse细胞能量代谢系统对线粒体功能进行评价,发现给予速效救心丸及藁本内酯、洋川芎内酯-Ⅰ后,线粒体基础呼吸值升高,线粒体最大呼吸容量显著增加,质子漏水平以及ATP生成量均有所提高,其中藁本内酯保护效果要优于速效救心丸组。③通过对糖酵解能力的检测,发现糖氧剥夺后,心肌细胞糖酵解能力旺盛。阳性药曲美他嗪和洋川芎内酯-Ⅰ均能显著增加细胞自身糖酵解能力、最大糖酵解能力以及最大糖酵解储备能力。而速效救心丸和藁本内酯可以有效提高心肌细胞糖酵解储备能力,但对最大糖酵解能力无显著影响。④通过对线粒体呼吸控制率以及复合物Ⅰ和复合物Ⅱ呼吸活性的测定,发现速效救心丸和洋川芎内酯-Ⅰ可以显著提高线粒体氧化磷酸化效率,对线粒体复合物Ⅰ和复合物Ⅱ具有保护作用。因此,速效救心丸、藁本内酯及洋川芎内酯-Ⅰ对糖氧剥夺所致线粒体损伤及线粒体功能障碍均具有保护效果。(4)基于前期研究结果发现速效救心丸及藁本内酯、洋川芎内酯-Ⅰ能保护线粒体结构的完整性,线粒体功能亦得到明显改善。因此,本研究进一步深入探讨速效救心丸、藁本内酯、洋川芎内酯-Ⅰ对糖氧剥夺心肌细胞线粒体凋亡的保护作用及其机制。本研究主要通过检测细胞外乳酸脱氢酶(LDH)活力、线粒体含量、细胞内Ca2+水平、线粒体膜电位、活性氧浓度、线粒体膜MPTP通道开放度以及细胞凋亡率,综合评价其对线粒体凋亡的保护作用,以及通过检测促凋亡蛋白Bax、抑凋亡蛋白Bcl-2、线粒体MPTP通道蛋白VDAC1、线粒体及胞浆细胞色素C水平、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶Caspase-3、凋亡诱导因子AIF,阐明速效救心丸对糖氧剥夺心肌细胞线粒体凋亡的保护作用机制。结果表明:速效救心丸可以显著抑制LDH的释放,增加细胞内线粒体含量,降低线粒体内Ca2+浓度,维持线粒体膜电位稳定,降低线粒体内ROS水平,抑制线粒体凋亡,此外其还通过调节Bax/Bcl-2比例,抑制MPTP通道的开放,减少细胞色素C由线粒体向胞外释放,抑制caspase 3表达的上升,阻断caspase凋亡途径,同时下调AIF的表达,从而抑制细胞凋亡。然而藁本内酯、洋川芎内酯-I可以显著抑制LDH的释放,增加细胞内线粒体含量,降低线粒体内Ca2+浓度,维持线粒体膜电位,降低线粒体内ROS水平,抑制线粒体凋亡,但其对MPTP通道的开放并无显著抑制作用,表明其并不是通过抑制MPTP通道的开放抑制线粒体凋亡,而发挥心肌细胞保护作用。结论:目前共从速效救心丸中鉴定15个苯酞类成分,且其中9个化合物吸收入血,其主要入血成分为藁本内酯和洋川芎内酯-I。在缺糖缺氧条件下,速效救心丸及其主要成分藁本内酯和洋川芎内酯-I均可通过抑制细胞内活性氧浓度和Ca2+水平的上升,保护线粒体结构和功能,抑制线粒体凋亡,可知藁本内酯和洋川芎内酯-I可能为速效救心丸抗心肌缺血线粒体保护的主要药效成分。此外,速效救心丸可通过抑制MPTP通道的开放,减少细胞色素C的释放,阻断caspase凋亡途径,从而抑制心肌细胞凋亡,发挥抗心肌缺血损伤的作用。

速效救心丸; 物质基础; 糖氧剥夺; 线粒体; 能量代谢; 藁本内酯; 洋川芎内酯-Ⅰ;

肖红斌;

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